光谱技术应用 | 吸光度
吸光度测量优势:
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无损测量-除非你的样品是光敏的,否则测量可以在不改变样品的情况下重复进行。
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定量结果-用吸光度测定溶液浓度。
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准确性和重复性-使用适当的工具和方法,吸光度可以被量化,具有很高的测量的精度。
一、吸光度与朗伯-比尔定律
当一束光通过一个吸光物质(通常为溶液)时,溶质吸收了光能,光的强度减弱;吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量,其影响因素有溶剂、浓度、温度。分析物浓度越高,穿过材料的光子被吸收的机会就越大。吸光度的测量简便高效,因此被广泛应用于液体和气体的光谱测量技术, 集成至工业测试系统,还可以用于科研分析。
二、如何计算吸光度?
当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度l成正比,而与透光度T成反比。
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吸光度单位 (AU) 是光谱仪测量浓缩样品能力的量度;
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Ocean的光谱仪的AU范围为0~1.75 AU,适用于大多数应用;
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HDX 光谱仪的 AU 范围为 0 – 3.5;
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杂散光是限制光谱仪 AU 范围的关键因素
![](http://nwzimg.wezhan.cn/contents/sitefiles2057/10287365/images/50810292.jpeg)
三、吸光度测量的应用案例
应用案例1:测量重铬酸钾吸光度标准品
图1.重铬酸钾标准品的紫外吸光度(浓度范围20.27-100.95 mg/L)
图1为使用Ocean HR2测得的紫外吸收谱,可看出Ocean HR2出色的低杂散光性能,特别是当绘制与浓度关系时,其吸光度线性度为0.9997(图2)。
图2.高吸光度线性度是Ocean HR2光谱仪的一个特点
蓝色线为重铬酸钾标准品的测量结果,基于该标准曲线,可预测该波长范围内1.5AU以下几乎任何样品的浓度。
应用案例2:牛血清白蛋白BSA
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测量前,将光谱仪和光源预热30分钟。预热有助于光源达到热平衡状态,避免由于光源输出的微小变化而导致的测量偏差; -
采样时避免取下石英比色皿,因为这样做可能会引入错误。正确的做法是,在比色皿中进行溶液稀释,使用一次性移液管吸取每个样品的一部分,然后在去离子水中混合,并对每个样品重复该过程; -
尽量避免测量中移动光纤。
图3.BSA样品在 279 nm 处有强烈的吸收峰
使用BSA测量的吸光度线性度结果甚至比重铬酸钾更好。取279 nm处的吸收峰(图3),吸光度直至2.5AU,也能保证吸光度线性度0.999(图4)。这种性能使Ocean HR2成为定量其他类型的蛋白质浓度及生物应用,如分析血液成分和对药物配方进行质量保证的绝佳选择。
图4. 近30个BSA样品上测得的吸光度线性度高达0.999