光谱技术应用 | 吸光度

 

从紫外到近红外再到更长的波长，吸光度测量提供了有关物质在所有状态下的化学成分的有价值的信息。

吸光度测量优势：

  • 无损测量-除非你的样品是光敏的，否则测量可以在不改变样品的情况下重复进行。

  • 定量结果-用吸光度测定溶液浓度。

  • 准确性和重复性-使用适当的工具和方法，吸光度可以被量化，具有很高的测量的精度。

 

 

一、吸光度与朗伯-比尔定律

 

当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱；吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量，其影响因素有溶剂、浓度、温度。分析物浓度越高，穿过材料的光子被吸收的机会就越大。吸光度的测量简便高效，因此被广泛应用于液体和气体的光谱测量技术, 集成至工业测试系统，还可以用于科研分析。

朗伯-比尔定律是光吸收的基本定律，是描述物质对某一波长光吸收的强弱与吸光物质的浓度及其液层厚度间的关系。朗伯比尔定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。
光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。吸光度直接取决于吸收分子的浓度和光穿过材料的光程，光程越长，检测限越低。高浓度样品需要较短的光程。光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。
朗伯-比尔定律计算公式：

其中，A(λ)为某波长下的吸光度值，ε(λ)为吸收系数，c为溶液的浓度（单位mol/L），l为溶液厚度（单位cm）。

二、如何计算吸光度？

 

当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度l成正比，而与透光度T成反比。

透过率T是透射光强度 (It) 与入射光强度 (I0) 的比值，并且会随着光程长度和浓度的增加而降低。通过透射率T来计算吸光度：

 

  • 吸光度单位 (AU) 是光谱仪测量浓缩样品能力的量度；

  • Ocean的光谱仪的AU范围为0~1.75 AU，适用于大多数应用；

  • HDX 光谱仪的 AU 范围为 0 – 3.5；

  • 杂散光是限制光谱仪 AU 范围的关键因素 

 

朗伯-比尔定律是一个线性方程。使用已知浓度的标准溶液测量吸光度值，吸光度与浓度之间可以建立一条线性关系的标准曲线；通过测量未知样品的吸光度值，从线性关系曲线中可以读取该样品的浓度值。
值得注意的是，随着浓度的增加，由于检测器的非线性，浓度值数据可能也会变得非线性。因此，在每个系统中需要对数据进行多项式校正。

三、吸光度测量的应用案例

 

应用案例1：测量重铬酸钾吸光度标准品

测量吸光度实验包括海洋光学HR2-UV-VIS光谱仪、带衰减器的DH-2000氘灯光源、两根400 μm光纤，石英比色皿、Square One比色皿支架和OceanView软件。

图1.重铬酸钾标准品的紫外吸光度（浓度范围20.27-100.95 mg/L）

图1为使用Ocean HR2测得的紫外吸收谱，可看出Ocean HR2出色的低杂散光性能，特别是当绘制与浓度关系时，其吸光度线性度为0.9997（图2）。

图2.高吸光度线性度是Ocean HR2光谱仪的一个特点

蓝色线为重铬酸钾标准品的测量结果，基于该标准曲线，可预测该波长范围内1.5AU以下几乎任何样品的浓度。

应用案例2：牛血清白蛋白BSA

牛血清蛋白（BSA）常用作生化应用中的蛋白质浓度标准品。使用与重铬酸钾实验相同的Ocean HR2光谱仪配置，在蒸馏水中测量了质量同为503mg的30种不同浓度的BSA。为确保获得最佳测量结果，建议在实验中应注意以下：
  • 测量前，将光谱仪和光源预热30分钟。预热有助于光源达到热平衡状态，避免由于光源输出的微小变化而导致的测量偏差；
  • 采样时避免取下石英比色皿，因为这样做可能会引入错误。正确的做法是，在比色皿中进行溶液稀释，使用一次性移液管吸取每个样品的一部分，然后在去离子水中混合，并对每个样品重复该过程；
  • 尽量避免测量中移动光纤。

图3.BSA样品在 279 nm 处有强烈的吸收峰

使用BSA测量的吸光度线性度结果甚至比重铬酸钾更好。取279 nm处的吸收峰（图3），吸光度直至2.5AU，也能保证吸光度线性度0.999（图4）。这种性能使Ocean HR2成为定量其他类型的蛋白质浓度及生物应用，如分析血液成分和对药物配方进行质量保证的绝佳选择。

图4. 近30个BSA样品上测得的吸光度线性度高达0.999